１．留鳥と家禽
　私たちの研究では留鳥として、カラスとムクドリとスズメについて調べました。用いた検体は、茨城県の県北家畜保健衛生所および県南家畜保健衛生所から提供して頂きました。茨城県では高度病原性鳥インフルエンザ対策の一つとして、留鳥であるカラス、ムクドリ、スズメでのインフルエンザ検査を実施しています。その検査が終了し、なおかつ検査結果が陰性であった検体を、私たちの研究室に分与して頂きました。
　カラスには、ハシブトカラスとハシボソカラスなどの種類がありますが、今回の検体については詳細は不明です。
　また、家禽としてはニワトリとシャモについて調べました。ニワトリとシャモはどちらも、茨城県内の農場で飼育されていたものです。ニワトリはブロイラー種ですが系統は不明で、約220日齢のメスです。シャモは831系統で約12ヶ月齢であり、性別は不明です。
　　　

２．腸内容物の希釈液の調整
　－80℃で凍結保存されてあった検体を譲り受け、私たちの研究室で検査を行う時に室温に戻してから、腸内容物を採取しました。
　腸内容物は、盲腸の分岐部から上方の小腸内容物を採取しています。この重量を測定し、滅菌PBSで10倍希釈液を調整した後、さらに10倍の段階希釈を行って、100倍液、1000倍液、10000倍液を調整しました。

１．ウエルシュ菌の選択培地と嫌気培養
　腸内容物の希釈液からのウエルシュ菌の分離のため、ウエルシュ菌用の選択培地として、カナマイシン入り10％卵黄CW寒天培地を用いました。
　この選択培地のプレートに腸内容物の希釈液を0.1 ml塗布し、38℃で一晩嫌気培養しました。嫌気培養のためには、プレートを密閉できるチャンバーや袋に入れて、その中に市販のケンキ・パックを入れました。ケンキ・パックは、酸素を吸収して、二酸化炭素を放出するため、密閉容器の中の酸素濃度は減少しますが、全体の気圧はほとんど変化しません。密閉容器の中が嫌気状態になるというわけです。

２．ウエルシュ菌の卵黄反応
　分離培養では、ウエルシュ菌はコロニーの周りが白く色が抜けているので識別することが可能です。ウエルシュ菌が産生するレシチナーゼという酵素の働きで培地成分中の卵黄が分解されたわけで、これを「卵黄反応」といいます。卵黄反応を示すコロニーが出現した個体はウエルシュ菌を保有していたと判定すると、ここでウエルシュ菌を保有する個体と保有していない個体にまず二分されて、ウエルシュ菌の保有率が算出されます。

　プレートに出現したウエルシュ菌のコロニー数をカウントして、そのプレートの希釈倍率に基づいて計算すると、その個体の腸内容物1グラムあたりのウエルシュ菌の菌量が算出されます。

　
　分離培養で卵黄反応を示しているコロニーは、まだウエルシュ菌であると同定されたわけではありません。
　私たちの研究室では、ウエルシュ菌の同定は、各種性状検査の結果に基づいて行うことにしています。性状検査の詳細については後で記述しますが、その性状検査を実施する前に、分離培養で得られたコロニーを純培養を繰り返し行って、他の菌種のコンタミネーションのない、単一種の純粋な菌株に純化する必要があります。

　純培養には分離培養と同じく、カナマイシン入り10％卵黄CW寒天培地を用います。分離培養で卵黄反応を示したコロニーを、火炎滅菌した白金耳で釣菌し、新しいカナマイシン入り10％卵黄CW寒天培地に塗布します。そして38℃で一晩嫌気培養を行います。これが純培養の１回目になります。　
　翌日にプレートを観察して、１回目の純培養の結果を確認します。この時に多くの場合、卵黄反応を示すコロニーと示さないコロニーが混在しているので、再びもう一度、純培養を繰り返す必要があります。純培養１回目のプレート上で卵黄反応を示しているコロニーを火炎滅菌した白金耳で釣菌し、新しいカナマイシン入り10％卵黄CW寒天培地に塗布して38℃で一晩嫌気培養します。これが純培養の２回目になります。